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酵母表达系统

酵母P. Pichia 表达系统是工业微生物中应用较广泛的系统,兼有了原核表达的周期短、成本低廉、易操作等优点,易于工业级别放大培养;同时具备了真核细胞对蛋白的空间折叠,糖基化修饰等能力,使得蛋白可溶性大幅度提高,为研究蛋白的生理活性提供了强有力的工具。毕赤酵母体系是真核体系中操作简单、成本低廉的系统,在蛋白加工、折叠、翻译后修饰等方面具有诸多优势,在毕赤酵母体系中蛋白转录后糖基化所增加的寡糖链长度(平均每个支链8-14 个甘露糖残基)非常接近高等真核生物的结构,活性几率大大高于原核体系。 鸿肽生物提供的酵母蛋白表达体系具有丰富的宿主细胞资源和载体选择经验,同时改造并开发了的GAP启动子的创新pYE-GAPα载体。进一步改善了蛋白诱导表达的操作步骤,无需在诱导过程中更换培养基,也无需在表达过程中检测甲醇含量,有效的提高细胞密度及蛋白产量。
酵母系统蛋白表达步骤及交付标准
1. 项目分析出具蛋白表达方案
周期
交付数据及材料
  • 密码子优化

  • 融合标签

  • 纯化方案

  • 可优选宿主细胞

1-2工作日

  • 项目预实施报告

2. 表达体系系统选择(客户提供表达菌株的略过此步骤,仅提供表达质粒的可选择需要电转化的表达菌株)

2.1 可选表达载体


GAP启动子载体:pYE-GAPα,;
常规商业化载体:分泌表达:pPICZαA、pPIC9K,
胞内表达:pPICZA、 pPIC3.5K

2.2 可选表达菌株


GS115,X33菌株
SMD116蛋白酶缺失型菌株
3. 毕赤酵母表达载体构建
周期
交付数据及材料
A. 基因优化
    亚克隆设计
    合成基因
B. 亚克隆至载体
C. 质粒中抽及线性化-10ug
基因合成:2周左右
亚克隆:1-2周
线性化 :2-3天
1、基因合成报告
2、测序验证报告
3、包含表达质粒的大肠杆菌DH10
4、表达质粒
5、线性化检测图片
4. 毕赤酵母蛋白表达鉴定
周期
交付数据及材料
D. 电击转化 
E. 阳性克隆子筛选(PCR法) 
F. 高拷贝菌株筛选(可选)
G. 表达小试(5-10菌株)
H. 表达分析鉴定(WB)
I. 定株,优化表达条件
电转化及鉴定: 1-2周
高拷贝筛选: 2-3周(可选)
表达小试及鉴定: 1-2周
6、阳性表达菌株
7、PCR鉴定阳性菌株图
8、高拷贝阳性菌株(可选)
9、小试表达流程报告
10、WB实验结果
11、小试表达总结
5. 毕赤酵母蛋白纯化及鉴定
周期
交付数据及材料
J. 放大培养2-5升
K. 表达上清液浓缩
L. Ni柱低压亲和纯化
M. PAGE分析纯化过程
N. WB鉴定纯化后蛋白
O. PFM检测(可选)
P. MS检测(可选)
放大培养: 2-3周
蛋白纯化: 1-2周
WB: 1周
PMF: 2-3周
MS: 1-2周
12、蛋白纯化流程报告
13、蛋白纯化原始图片
14、发货蛋白
15、Western Blot(标签抗体)
16、蛋白指纹图谱(可选)
17、蛋白质谱分子量(可选)

补充说明

1、毕赤酵母细胞对密码子偏爱性要求较高,建议进行基因优化后再进行表达以提高成功率。
2、正常情况下采用分步收费原则来收取费用,特殊订单承诺不成功不收费。
3、不同的蛋白表达量差异很大,我们会尽量提供mg级别以上的蛋白量给客户。